Precyzyjne wykrywanie oraz identyfikacja niedozwolonych srodkow dopingujacych w organizmie sportowcow, uczestniczacych w zawodach (a takze wyrywkowo, w trakcie kontroli poza zawodami), jest zasadniczym elementem wspolczesnego systemu przeciwdzialania dopingowi w sporcie. Wynika to z przyjetej obecnie definicji dopingu, wedlug ktorej podstawowym kryterium diagnostycznym i dowodowym stosowania niedozwolonych srodkow jest stwierdzenie w moczu sportowca okreslonego zwiazku lub jego metabolitu, bądź tez przekroczenie dopuszczalnego progu (limitu) jego stezenia. Obecnie w laboratoriach antydopingowych, poza analizami moczu, przeprowadzane są rowniez badania probek krwi i innych materialow badawczych (np. wlosow).
Stad tez wynikaja wysokie wymagania stawiane badaniom, prowadzonym w laboratoriach antydopingowych, oraz dazenie do stałego udoskonalania metod wykrywania oraz identyfikacji zakaza-nych zwiazkow.
Wysilki zmierzajace w tym kierunku przyniosly, w ciagu ostatnich lat, szereg nowych rozwiazan w dziedzinie techniki instrumentalnej i analitycznej. Dzieki temu znacznie rozszerzyly się możliwości badan analitycznych, a uzyskane wyniki staly się wiarygodne. Warto, chocby pobieznie, zapoznac się
z aparatura, badawcza nowej generacji, stanowiaca. zasadnicze wyposazenie czolowych laboratoriow antydopingowych. Sposrod nowych rozwiązan i innowacji technicznych pragne ukazac trzy rodzaje aparatow, ktorych zastosowanie okazalo się wyjatkowo korzystne.
Jednym z trudniejszych problemow, ktore nalezalo rozwiazac w toku badan antydopingowych bylo rozroznienie endogennych androgenow, takich jak testosteron, dihydrotestosteron (DHT) i dehydro-epianarosteron (DHEA), od ich syntetycznych pochodnych, stosowanych w celach dopingowych. Na podstawie wynikow rutynowych analiz antydopingowych nie mozna bylo rozstrzygnac, czy związki, ujawnione w moczu badanego sportowca, byly pochodzenia egzogennego, czy tez zostaly wytworzone w sposob naturalny w jego organizmie. Odroznienie androgenow egzogennych (syntetycznych) od wytwarzanych endogennie stalo sie. mozliwe dziejci wprowadzeniu nowej generacji aparatow .
GC/C/IRMS - nowa metoda
bezposredniego wykrywania
syntetycznego testosteronu
i endogennych androgenow
Udowodnienie przyjmowania preparatow testosteronu, w celu zwiejcszenia osiagniec, stalo sie. zasadniczym problemem z chwila zaliczenia testosteronu przez Komisje. Medyczna MK0L do srodkow dopingowych (1982 rok, po Igrzyskach Olimpijskich w Moskwie).
Przyjecie w 1983 roku przez Manfreda Donikego (profesora w Deutschen Sporthochschule w Kolonii), podwyzszonej wartosci wskaznika T/Et w analizach GC/MS za kryterium przyjmowania testosteronu w celach dopingowych bylo pierwszym krokiem w kierunku rozwiazania tego problemu. Chociaz badania populacji sportowcow ujawnily, ze srednie wartosci tego wskaznika wynosza l,0±0,9, to jednak, aby uniknac falszywie dodatnich wynikow testu, Komisja Medyczna MK0L przyjeła za dopuszczalna wartosc T/Et = 6, a zatem wszystkie wyniki ponizej tej wartosci uznawane sa za negatywne. Pozniejsze badania wykazaly, ze przyjecie powyzszych zalozen nie eliminuje trudnosci interpretacyjnych. Okazalo się np., ze podanie 250 mg testosteronu osmiu chinskim sportowcom spowodowalo podwyzszenie wskaznika T/Et tylko u trzech z nich, utrzymywujace się przez 1 dzien . Reagowali oni wiec odmiennie niz sportowcy rasy bialej (kaukaskiej). Na tej podstawie wnioskowano, ze u sportowcow pochodzenia azjatyckiego moga. wystepowac wyniki falszywie ujemne.
Skutecznym sposobem obnizania T/Et ponizej dopuszczalnej wartosci okazalo się jednoczesne przyjmowanie epitestosteronu z preparatami testosteronu. Tak wiec istniala rowniez mozliwosc falszowania wynikow tego badania.
Z drugiej strony, wartosci wskaznika T/Et powyzej 6, majace wskazywac na przyjmowanie egzogennego testosteronu, moga. byc efektem naturalnego zmniejszenia wydalania epitestosteronu. Z tego wzgledu Komisja Medyczna MK0L dopuszczalna , graniczna wartosc tego wskaznika podniosla do 10, zas wyniki pomiedzy 6 a 10 podlegaly weryfikacji poprzez dalsze badania (endo-krynologiczne).
Okazalo się ponadto, ze na wzrost T/Et moga wplywac rowniez takie czynniki, jak: spozycie alkoholu (zwlaszcza u kobiet), nieodpowiednie przechowywanie probek i rozwoj pewnych szczepow flory bakteryjnej w moczu , a wiec czynniki zupelnie nie zwiazane z przyjmowaniem syntetycznych preparatow testosteronu. Wszystko to sprawilo, ze udowodnienie przyjmowania testosteronu w celach dopingowych, nawet przy wysokich wartosciach wskaznika T/Et, stalo sie. problematyczne (odszkodowawcze procesy cywilne z reguiy konczyly się wygrana sportowcow, oskarzonych o doping).
Żeby przelamac ten impas, nasilily się poszukiwania metod bardziej skutecznych. Takim rozwiazaniem okazala się nowa metoda, wykorzystujaca urzadzenie, nazywane w skrocie GC/C/IRMS. Sklada się ono z chromatografu gazowego (gas chromatography - GC) sprzęzonego z komora spalania (combustion - C) oraz spektrometrem masowym (mass spectrometry - MS) i umozliwia bezposrednie wykrywanie syntetycznych androgennych hormonow w analizowanych probkach moczu sportowcow. Badanie oparte jest na tym, ze syntetyczny testosteron zawiera mniejsza ilosc izotopu wegla 13C niz hormon naturalny, powstajacy w organizmie. Okreslenie stosunku izotopow wegla 13C/12C, pochodzacego z testosteronu wyizolowanego z badanej probki moczu, pozwala ustalic, czy jest to hormon naturalny, czy tez syntetyczny.
W komorze spalania w wysokiej temperaturze (+850°C) dochodzi do spalenia wyizolowanego zwiazku (np. testosteronu) do podstawowych skladnikow H2O i CO2. Wegiel powstaly z CO2 jest nastepnie analizowany w spektrometrze masowym, wyposazonym w detektor izotopowy, ktory pozwala na oznaczenie stosunku izotopow wegla 13C/12C (Isotope Ratio Mass Spectrometry - IRMS).
W pierwszym etapie analizy w chromatografie gazowym nastepuje rozdział badanego materialu i wyizolowanie, w okreslonym czasie retencji, piku testosteronu lub innych interesujacych nas zwiazkow endogennych androgenow, (ktore nastepnie podlegaja spaleniu w komorze spalania do H2O i CO2).
W detektorze IRMS okresla się stosunek 13C/12C w promilach, oznaczany symbolem [513C (%o)] wobec wzorcowego gazu o standaryzowanym stosunku 13C/12C. Analiza ta wymaga dokladnego oczyszczenia izolowanego piku testosteronu, ktorego stezenie powinno wynosic okolo 50 ng. Procedura badawcza wymaga wiec wstepnego zageszczenia probki moczu i izolowania testosteronu na kolumnach chromatografu cieczowego wysokocisnieniowego (HPLC).
Jak ustalono w drodze badan eksperymentalnych, podanie 1 tabletki 40 mg preparatu testosteronu (Andriol) powodowalo wzrost T/Et powyzej 6, który utrzymywal sie. do 2 godzin, zas wynik 13C/12C, wskazujacy na przyjcie egzogennego testosteronu, utrzymywal się do 10 godzin (mimo powrotu wskaznika T/Et do wartosci prawidlowej). Badanie tą metoda pozwala na wykrycie stosowania egzogennego testosteronu nawet u osob z wrodzonym niskim poziomem wskaznika T/Et (np. u Azjatow). Natomiast podwyzszenie wskaznika T/Et do wartosci 14,7 nie zawsze znajdowalo potwierdzenie w analizach GC/C/IRMS, ktore dawaly wynik calkowicie negatywny .
Oznaczanie wskaznika T/Et nalezy wiec uznac za badanie wstepne . W przypadku przekroczenia wartosci 6,0 Komisja Antydopingowa moze rozszerzyc badanie probki B o wykonanie dodatkowego testu, określającego stosunek izotopow wegla 13C/12C (IRMS). Wynik ten bedzie podstawa ostatecznej oceny badania antydopingowego. Badanie to zastepuje uprzednio wykonywany w tych przypadkach test ketokonazolowy. Pozwala takze rozstrzygnać, czy wysoki poziom epitestosteronu, stosowanego w celu maskowania przyjmowania testosteronu i utrzymujacy wartosc wskaznika T/Et w granicach prawidlowych, jest pochodzenia egzogennego, czy tez jest naturalnie wytwarzany w organizmie sportowca.
Wysoka cena aparatu GC/C/IRMS (okolo 200 000 dolarow amerykanskich) oraz pracochlonna procedura przygotowania probki i przeprowadzenia analizy nie pozwalaja na zastosowanie tej metody do rutynowych analiz. Wyniki oznaczen, uzyskiwane przy uzyciu tej metody, stanowia_ wazny dowod w procesach sajlowych, w toku ktorych dochodzi do częstego podwazania materialu dowodowego.
W obowiązujacym w latach 2001-2002 wykazie zakazanych farmakologicznych klas srodkow i metod dopingu, podanym w Aktualnym Dodatku A Kodu Antydopingowego MK0L z 1 wrzesnia 2001 roku, zmieszczono nastepujaca uwage „ W celu podjqcia ostatecznych decyzji, w przypadkach podejrzenia stosowania testosteronu, lub innych endogennych androgenow, nalezy brać pod uwagq zarowno wyniki zaburzen profilu steroidowego w moczu, jak i pomiar stosunku izotopow".
CONQUER ALL